Los machos y las hembras nacen con espolones en el tobillo, sólo los del macho liberan veneno, compuesto principalmente por proteínas similares a defensinas (péptidos ricos en cisteinas que se encuentran en vertebrados e invertebrados y funcionan como antibióticos naturales que se hallan en la superficie de la piel, estas son activas contra bacterias, hongos y virus), tres de las cuales son únicas en el ornitorrinco.
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| Espolón de un ornitorrinco |
Las defensinas son producidas por su sistema inmunitario. A pesar de que el veneno es lo suficientemente potente como para matar animales pequeños, o incluso perros, no es letal para los humanos, aunque tras una picadura pronto aparece un edema alrededor de la herida que se extiende gradualmente por el miembro afectado y causa un dolor tan intenso que ni siquiera puede ser calmado con morfina.
El veneno se produce en las glándulas crurales (del muslo) del macho, unas glándulas alveolares en forma de riñón conectadas al espolón calcáneo de ambas patas posteriores a través de un conducto con paredes delgadas. Las hembras, al igual que en los equidnas, nacen con púas rudimentarias que no se desarrollan y caen antes de que lleguen a alcanzar un año de edad y carecen de glándulas crurales funcionales.

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